复合益生菌发酵不同基料乳酸菌饮料中挥发性代谢物差异分析（一） 同基接种发酵剂所得发酵基料

乳酸菌饮料是复合发性指以乳或乳制品为原料，经化料、益生饮料异分水合、菌发酵杀菌，同基接种发酵剂所得发酵基料，料乳按照一定比例混入水、酸菌食品添加剂（甜味剂、中挥酸味剂、代谢稳定剂）调配后制得的物差饮料。乳酸菌饮料作为健康饮品以其独特的复合发性风味和优质的保健功效赢得广大消费者的追捧。相关资料显示，益生饮料异分近5年，菌发酵世界乳酸菌饮料市场份额不断增加，同基其市场规模超过500亿美元。料乳益生菌是酸菌一类能够改善宿主肠道菌群平衡并有效增强食用者身体健康水平的活性有益微生物，其具有改善便秘、缓解腹泻、抗肿瘤、保护口腔健康等重要生理功效；Buriti等应用L.rhamnosusLR-32和B.lactisBB12复配发酵山羊乳清饮料，并添加适量的膳食纤维，所得产品在贮藏期（4℃、24d）内活菌数维持在1×108CFU/g以上，膳食纤维的添加能够改善山羊乳清饮料的口感、风味并增进其功能特性，活性乳酸菌饮料将菌株的益生特性与乳制品的健康功效完美结合，同时乳酸菌在发酵过程中产生多种维生素、有机酸、抗菌肽等生物活性物质能够有效提高产品的功能特性。近年来，国内外学者主要针对基础发酵剂在发酵乳中的产香机理进行研究，而对于复合益生菌在发酵乳制品中的挥发性代谢物及产香机制研究较少。Karacali等研究开菲尔粒对双蛋白乳饮料（按牛奶与豆奶质量比17:3混合）挥发性风味物质的影响时发现，应用开菲尔粒发酵能够促进双蛋白饮料中双乙酰、乙偶姻等具有脂肪香、奶油气息等挥发性风味物质的产生，降低其（E）-2-己烯醛、1-己醇等致豆腥味挥发性风味物质的含量。固相微萃取-气相色谱质谱联用技术（SPME-GCMS）具有操作简单、灵敏度高、分析范围广等特点，目前，该技术主要用于乳制品、肉制品以及发酵果蔬中风味物质的检测。

本研究以含有8株菌株的复合益生菌发酵3种基料的乳酸菌饮料为对象，应用SPME-GC-MS技术结合多元统计分析乳酸菌饮料发酵及贮藏期内挥发性代谢物的变化，通过OAＶ值确定乳酸菌饮料中的关键挥发性风味物质，对3种基料的乳酸菌饮料整体风味进行比较预测，为复合益生菌的商业化应用及活性乳酸菌饮料的研发提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料与仪器

试验菌株本试验所用益生菌（见表1）直投式发酵剂由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室提供。

1.1.2仪器与试剂

SRH60-70高压均质机，上海申鹿均质机有限公司；电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；气相色谱-质谱联用仪（Agilent7890BGCsystem-5977AMSD），赛默飞世尔科技有限公司；色谱柱（HP-5毛细管柱30m×0.25mm，0.25μm），赛默飞世尔科技有限公司；手动固相微萃取（SPME）进样手柄（USA，SUP-ELCO），赛默飞世尔科技有限公司；固定搭载装置及50/30μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷萃取头，赛默飞世尔科技有限公司；陶瓷加热磁力搅拌器（Corning），美国Agilent公司；脱脂乳粉（蛋白质含量33%），新西兰NZMP；浓缩乳清蛋白粉（蛋白质含量80%），美国HILMAR公司；大豆分离蛋白粉（蛋白质含量95%，富吉普乐200），吉林不二蛋白有限公司；C3-C9正构烷烃混标（AccuStandard，USA）、C10-C25正构烷烃混标（AccuStandard，USA）、丙酮（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、1，2-二氯苯（色谱纯）等均购于美国Sigma公司。

1.2试验方法

1.2.1乳酸菌饮料的制备

分别将脱脂乳粉（12.1%）、乳清蛋白粉（5.0%）、大豆分离蛋白粉（4.2%）与葡萄糖（2%）混合溶解于预热至55℃的蒸馏水中，水合30min，85℃杀菌15min，冷却至37℃，将复合菌株按照总接种量5×106CFU/g接入3种不同发酵基料中，具体接种量如表2所示，3种发酵基料蛋白质含量均为4%，然后置于37℃恒温培养箱中发酵，待到达发酵终点得发酵基料（复合益生菌在3种基料中生长至稳定期）；将发酵基料与预先溶解并冷却的稳定剂、甜味剂混合，调配，20MPa均质，所得样品（蛋白质含量均为1%）即为发酵基料不同的3种乳酸菌饮料。

1.2.2发酵前及贮藏期内挥发性风味物质的测定

采用50/30μmDＶB/CAR/PDMS萃取头，对发酵前及发酵结束后贮藏0，14，28d的脱脂乳饮料、豆乳饮料、乳清饮料进行富集，每组3个平行，随后应用GC-MS技术对其挥发性风味物质进行检测分析。

1.2.3挥发性风味物质的萃取条件与测定条件

1）色谱条件载气为He，流速1.0mL/min；不分流进样，进样口温度250℃。程序升温方式，起始温度为35℃，保持5min后以5℃/min的速率上升至140℃，保持2min，再以10℃/min的速率上升至250℃，保持3min。

2）质谱条件全扫描模式；EI离子源；电子能量70eＶ；离子源温度230℃；质量扫描范围m/z35～500；无溶剂延迟。

3）SPME萃取条件50℃平衡60min。

4）解吸附条件250℃条件下解吸附3min。

1.2.4定性、定量分析

定性方法：利用随机携带Masshunter工作站NISＴ11标准库进行自动比对，挑选匹配率≥85%的物质作为鉴定结果，同时依据Ｖandendool等的方法测定保留指数（retentionindices，RI），根据文献报道的RI值对发酵乳样品中的挥发性风味物质进行再次鉴定，RI值计算公式如下：

式中：RＴ_（z）、RＴ_（z+1）和RＴ_（x）分别为正构烷烃碳原子数为Z、Z+1和待测物x的保留时间，且RＴ_（z）＜RＴ_（x）＜RＴ_（z+1）。

定量方法：在5mL发酵样品中添加质量浓度为0.01μg/L的内标物1，2-二氯苯溶液50μL，样品中各组分风味物质的浓度可代入公式（2）计算：

式中：C_i—待测样品中各风味化合物质量浓度，μg/L；Cs—1，2-二氯苯质量浓度，μg/L；A_i—样品中待测物质对应的色谱峰面积；As—内标物色谱峰面积。

1.2.5香气活度值评价法

在对乳酸菌饮料中挥发性风味化合物定量的基础上，以各风味化合物在水中的风味阈值作为参考，计算能表征风味化合物贡献率的物理量—香气活度值（odoractivityvalue，OAＶ）。可代入公式（2）计算：

式中：OAV_i—风味化合物i的香气活度值；

C_i—乳酸菌饮料中挥发性风味化合物质量浓度，μg/L；OT_i—所测风味化合物在水中的气味阈值。

1.3数据处理

应用SPSS21.0软件进行显著性、主成分分析处理，使用Originlab2017、SIMCA-P14.1作图。

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